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Apr 10, 2024Apr 10, 2024

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12383 (2023) Citar este artigo

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Esferóides tumorais multicelulares incorporados em matrizes de colágeno I são sistemas in vitro comuns para o estudo de tumores sólidos que refletem o ambiente fisiológico e as complexidades do ambiente in vivo. Embora os ambientes de colágeno I sejam fisiologicamente relevantes e permissivos à invasão celular, o estudo de esferóides em tais hidrogéis apresenta desafios para os principais ensaios analíticos e para uma ampla gama de modalidades de imagem. Embora isso se deva em grande parte à espessura dos hidrogéis 3D que em outras amostras normalmente pode ser superada por seccionamento, devido à sua natureza altamente porosa, os hidrogéis de colágeno I são muito difíceis de seccionar, especialmente de uma maneira que preserva a rede de hidrogel incluindo células padrões de invasão. Aqui, descrevemos um novo método para preparar e criossecção de esferóides invasivos em uma matriz de dois componentes (colágeno I e gelatina), uma técnica que denominamos criossecção de esferóides in vitro de hidrogel duplo de amostras tridimensionais (DISC-3D). DISC-3D não requer fixação celular, preserva a arquitetura de esferóides invasivos e seus arredores, elimina desafios de imagem e permite o uso de técnicas que raramente têm sido aplicadas na análise tridimensional de esferóides, incluindo microscopia de super-resolução e imagens de espectrometria de massa .

O estudo in vitro de células cultivadas em substratos planos bidimensionais (2D) tem sido empregado há mais de um século e tem sido crucial em inúmeras descobertas científicas. Embora a cultura de células 2D continue a ser um método padrão em biologia molecular e celular, há muito se sabe que ela não pode recapitular aspectos críticos de sistemas in vivo, incluindo interações tridimensionais (3D) célula-célula e célula-ambiente . Tais interações são particularmente importantes no estudo de processos celulares explicitamente emergentes e multicelulares; por exemplo, no desenvolvimento e no crescimento e progressão de tumores sólidos.

Nos últimos anos, a cultura de células 3D tem sido cada vez mais empregada2. Aqui, entidades multicelulares são cultivadas ou preparadas a partir de linhas celulares ou tecidos de pacientes – normalmente denominados esferóides e organoides, respectivamente – e cultivadas em hidrogéis sintéticos ou naturais que imitam a matriz extracelular in vivo. Foi demonstrado que a cultura celular tridimensional replica melhor a fisiologia do tecido humano, como gradientes de nutrientes e oxigênio, diferentes zonas proliferativas e interações célula-célula e célula-matriz, fornecendo uma justificativa clara para o uso da cultura 3D para estudar questões biológicas que são natureza multicelular3,4,5,6. Entre os hidrogéis 3D, os ambientes de colágeno I apresentam relevância fisiológica particular para muitos tumores sólidos. No câncer de mama, a alta densidade de colágeno I é um fator de risco conhecido para o desenvolvimento da doença7,8 e a densidade específica e a organização aérea das fibras de colágeno ao redor dos tumores estão associadas ao prognóstico9. As interações entre as células e o microambiente estromal rico em colágeno também são importantes no câncer pancreático10,11 e têm sido implicadas em uma variedade de outros cânceres12. O colágeno I também é um ambiente atraente para cultura de células 3D, pois sua bioquímica e estrutura de rede apoiam uma invasão celular eficiente. Além disso, é um ambiente no qual propriedades físicas, como largura da fibra, tamanho dos poros e rigidez do hidrogel, podem ser facilmente ajustadas sem alterar a composição bioquímica, permitindo o estudo dos efeitos dessas propriedades no modo invasivo e na eficiência celular . .

Apesar de estar bem estabelecido que a cultura de células 3D, e os hidrogéis de colágeno I em particular, fornecem um alto grau de relevância fisiológica e oportunidades para separar a importância da bioquímica das propriedades físicas no comportamento celular, a adoção da cultura de células 3D tem sido relativamente lento. A relutância decorre, em parte, dos desafios associados à aquisição de imagens de microscopia óptica de alta resolução em tais ambientes6. As células detectam e respondem à rigidez ambiental em distâncias de pelo menos dezenas, e possivelmente bem mais de cem, mícrons . Como tal, para que as células se comportem como se comportassem num ambiente 3D isotrópico, elas devem ser posicionadas bem acima dos substratos de imagem rígidos. Isto pode resultar em células que estão além da distância de trabalho das objetivas típicas de alta abertura numérica, alto sinal de fundo devido à dispersão fora do plano de imagem e autofluorescência das células ou do hidrogel ao redor das células. Além disso, o ambiente 3D pode dificultar a difusão de pequenas moléculas ou anticorpos através da amostra, inibindo tanto os estudos de drogas como a introdução de rótulos fluorescentes nestes contextos. Os desafios associados às amostras 3D podem ser especialmente agudos nas abordagens mais ricas em informações, como imagens ópticas de super-resolução, onde o alto sinal-ruído é fundamental, abordagens correlativas nas quais múltiplas modalidades são empregadas e abordagens não ópticas, como espectrometria de massa. imagens onde a dispersão de amostras espessas impede a coleta de dados, exceto na superfície da amostra.

 0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p> 0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p> 100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

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